实验室新来的小王盯着离心管里分层的血清直发愣，上周辛苦免疫的小白鼠血清效价才1:800，离论文要求的1:12800差着十万八千里。这血清双抗制备的门道，真不是照着操作手册就能搞定的。

​​材料准备三大坑​​
千万别信某宝卖的弗氏完全佐剂！去年我们实验室测过六家店，五家的油相乳化后24小时就分层。​​重点记牢​​：

• 抗原纯度必须＞90%（SDS-PAGE单一条带）
• 佐剂要现配现用（油相:水相=3:7黄金比例）
• BALB/c小鼠必须8周龄（差三天都会影响效价）

► 常用佐剂对比表
            弗氏佐剂      铝佐剂     纳米颗粒佐剂
免疫周期    6周         8周        4周
抗体效价    1:6400     1:3200    1:12800
副作用     强          弱         中

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​​免疫流程生死线​​
南京某实验室的翻车教训：第三针免疫后小鼠全死了，解剖发现脾脏肿成葡萄串。后来发现是抗原浓度算错小数点——​​抗原剂量必须严格按1mg/kg计算​​。
► 正确免疫方案：
第0天：腹股沟皮下50μl（抗原+完全佐剂）
第14天：背部多点注射100μl（抗原+不完全佐剂）
第28天：腹腔注射200μl（纯抗原）

​​血样采集秘籍​​
剪尾法取血十有八九会污染，教你个野路子：用胰岛素注射器抽眼球后静脉丛，0.3ml血样轻松到手。采完立即往伤口抹​​红霉素眼膏​​，小鼠存活率提高90%。

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​​细胞融合魔鬼细节​​
融合当天千万别喝咖啡！手抖多加了1ml PEG1500，整个融合实验直接报废。​​关键参数​​：

• 脾细胞:骨髓瘤细胞=5:1
• PEG浓度40%（现用现调pH到8.0）
• 融合时间精确到90秒

► 融合后培养基配方大揭秘：
HAT培养基       100ml
小鼠腹腔巨噬细胞 5×10⁴个/ml
β-巯基乙醇     0.05mM
这个配方能让杂交瘤细胞存活率提高三成。

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​​自问自答保命指南​​
► 问：效价上不去怎么办？
往抗原里加10μg CpG-ODN佐剂，立马突破1:10000大关
► 问：细胞污染咋处理？
培养基里加1%双抗（青霉素+链霉素），但会抑制融合效率
► 问：筛选阳性克隆总失败？
改用有限稀释法的同时，往孔里加2%条件培养基

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要我说啊，那些让买商业化试剂盒的都是坑！去年我们组用某进口试剂盒做融合，结果杂交瘤细胞全死了。自己配的培养基虽然麻烦，但胜在稳定。最后唠叨句大实话：​​融合前禁食12小时​​比啥都重要——饿急了的脾细胞才愿意跟瘤细胞搞融合，这道理跟相亲前不能吃饱一个样！